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本发明公开了一种多层次结构再生蚕丝蛋白/MXene复合纤维制备方法,该方法包括以下步骤:(1)、将从废旧蚕丝原料中提取出的再生蚕丝蛋白溶液与MXene纳米片、Ca2+离子混合、搅拌,使再生蚕丝蛋白与MXene纳米片、Ca2+离子按照质量百分比分别为40‑99%、0.5‑59.5%、0.5‑59.5%进行多重化学键自组装,得到再生蚕丝蛋白/MXene复合纤维纺丝原液;(2)、将再生蚕丝蛋白/MXene复合纤维纺丝原液采用微流控技术进行湿法纺丝并辅以后牵伸处理,得到具有多层次结构再生蚕丝蛋白/MXene复合纤维。本发明通过调控复合纤维内的多层次三维网络交联结构提高再生蚕丝蛋白复合纤维的力学性能。